经过20多年进一步的类似实验，罗斯(W. C. Rose)和他的同事们发现即使不喂蛋白质，而是以氨基酸混合物来替代的幼鼠也能生长得很好。表IV.C.2.1总结了他们发现的20多种存在于动物蛋白中的氨基酸，一些是必不可少的(必需的)，一些是如果饮食中没有，小鼠能够自己合成的(非必需的)。进一步的工作方向是推导出小鼠获得最佳生长所需的每一种必需氨基酸的量。
另一系列研究比较了不同蛋白质来源(或混合物)对小鼠生长的相对价值。来自不同素食(谷物、豆类等)的混合蛋白质都支持小鼠的生长，但是和牛奶、肉类或蛋类带来的增长程度不大一样。大多数谷物中的第一限制性氨基酸(意即单独增加这种氨基酸会促进生长)是赖氨酸。这是可以预想到的，我们已经知道赖氨酸是小鼠生长中所需要的，而谷物中赖氨酸分析值很低。相应的，大多数豌豆和蚕豆的第一限制性氨基酸是甲硫氨酸。因为这两种食材有不同缺陷，人们猜想谷类和豆类的混合物会使小鼠生长得更好，并得到了实验证实。
人类需求小老鼠，用来做模型还可以，但和人类有太多的不同(即使是在本文范畴中差异也是巨大的)。人类的一生中大多数时间都是成熟的个体，不再发育成长，但是需要蛋白质来“维护保养”。和鼠类相比，童年时期人类的生长相当缓慢。结果，我们要花大约6个月时间体重才会较出生时增长一倍，而小鼠只需要几天。到六个月时，小鼠就已经完全成熟了，而人类婴儿才长到成年体重的十分之一。此外，尽管鼠类的组织蛋白质和人类的相似，毛发蛋白质却非常不同，鼠类需要自己合成的蛋白质比例更高一些。
因此，研究人类的必需氨基酸是不是和小鼠一样是有必要的。但是让孩子长期食用不适当的实验性饮食来比较他们的成长率并不现实(也不道德)，一般的实验方法是让成年志愿者食用以氨基酸混合物代替蛋白质的实验性饮食，为期大约两周。
没有必需氨基酸，身体在很短的几天里就会表现出氮失衡(有负氮平衡这个术语吗，我觉得用失衡好一点)，也就是说在尿液和粪便中排出的结合氮加上头发和皮肤脱落时损失的少量的氮，超过了每日氮摄入量。幸运的是，短期的失衡对人类没有什么坏处，恢复正常饮食后身体就会迅速恢复氮储备。
这项研究的第一个主要发现就是人类对必需和非必需氨基酸的需求和幼鼠是一样的。不过，研究人员惊讶地发现为了保持氮平衡而需要的每种必需氨基酸的需求量都相当低。实际上，所有必需氨基酸的需求总量只占蛋白质需求量的16%，即使它们组成的蛋白质大约占人体蛋白质的45%。。因此，似乎任何达到最低蛋白质需求总量的食物组合，都能自动满足成年人对每一种必需蛋白质的需求。但对于幼小的孩子，似乎还是设置一个较高的氨基酸标准比较安全，差不多和母乳中蛋白质的组成一致。年龄大一些的孩子，正式建议采用折中的方案，选取保持成年人氮平衡的蛋白质需求量和母乳中蛋白质含量间的中间数值。这些标准总结在表IV.C.2.2里。
对于只根据短期氮平衡实验结果制定的最低标准的实施，最近有些批评的声音，麻省理工学院(MIT)的V•R•杨(V. R. Young)(1986)及其同事(1988，1989)认为这种实验方法本身就有误差来源。这些研究人员进行了以饮食中氨基酸含量为基础的精密研究，使用同位素标记单个氨基酸以便追踪它的新陈代谢。他们认为，相对于总蛋白需求量的必需氨基酸需求率，和它们在体内存在的比例十分接近。即使受试者来得及调整自身以应对低摄入，但身体组织的更新率同时也会降低，在一段时间之后，就有可能产生消极效果。
就像一个多世纪前阿特沃特提出的那样，摄入高于氮平衡需求的蛋白质，长期而言可能会有一些微妙的益处。不过，目前还没有相关研究来弄清楚人在长期蛋白质含量仅够维持氮平衡，而其他营养供应良好的条件下的生存状况。不管怎么说，虽然麻省理工学院研究小组建议的氨基酸水平更高，但大多数人的日常饮食显然完全满足这一要求，至少在发达国家如此。
不同食品的蛋白质含量标明食品中蛋白质含量的最直观的方式是重量百分比，如“克每100克”。但是这种衡量方法可能导致误解。例如，普通白面包的蛋白质含量可能是牛奶的3倍，因为牛奶中90%都是水，而面包中只有34%的水分。另一种方法是比较干重相同的物质中蛋白质的含量，但是衡量绝大多数干物质的营养价值的常用方法是指出它能产生多少可用能量，这个方法并不区分干物质是碳水化合物、脂肪还是蛋白质。因此，营养学家发现，比较不同食物中蛋白质与总卡路里值的比例更有帮助。这可以表示为“克每100千卡”，但是将浓度表示为“蛋白质卡路里占总卡路里的百分比”(PCals%)会更为容易(因为蛋白质本身的平均能量值是4千卡/克)。
